标题:免疫光学思思热99re热在线视频术之免疫组织化学法

信息分类:站内新闻   作者:yiyi发布   时间:2011-12-7 23:17:59 将本页加入收藏

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正文:

免疫光学思思热99re热在线视频

免疫金之免疫组织化学法
免疫光学思思热99re热在线视频术
1. 固定:小片组织放入下列固定液:2%对位甲醛(paraformaldehyde),1.25%戊二醛(glutaraldehyde),以50 mM PIPES pH 7.2之缓冲液配制,含2 mM CaCl2。把组织样品在4℃下固定12-24小时。
2. 包埋:用50 mM PIPES缓冲液冲洗被固定的组织3次,每次15分钟。以酒精系列进行脱水(30、40、50、60、70、80、95、100%×2酒精);每个步骤10到15分钟。将组织以石腊包埋。避免温度超过58℃以上。
3. 切片:切下厚度5 m并黏贴在载玻片上。使用卵蛋白素(ovalbumin)或组织黏着物当作黏剂。若以Poly-L-lysine当黏着剂会有较深的背景色。假如可获得干净的载玻片就不要使用任何黏着剂。因为黏着剂会有一些背景颜色。
4. 脱腊:以二甲苯(xylene)脱腊
              二甲苯I        5分钟
              二甲苯II        5分钟
5. 水化:依序以系列酒精水化:
              95%酒精        5分钟
              95%酒精        5分钟
              85%酒精        5分钟
              70%酒精        5分钟
              50%酒精        5分钟
              蒸馏水        5分钟
6. 清洗和染色:
(1) 此反应需在潮湿状态下完成,且使用抗体的量尽量减到最少的程度,
   即要在最少量缓冲液中完成反应。
(2) 用PBS清洗                                     5分钟×2
(3) 将载玻片平放,取Blotto 50-200 l覆盖在材料上,浸泡20分钟到1小
   时。
(4) 以PBS冲洗。
(5) 加50-200 l的一级抗体(以Blotto适量稀释或以preimmune serum当对
   照)于材料上。
(6) 以PBS冲洗。                                   15分钟×4
(7) 加ImmunoGold(或protein A)于材料上。1小时(以Blotto稀释)。
(8) 以PBS冲洗。                                       15分钟×3
(9) 用蒸馏水冲洗。                                     15分钟×3
(10) 将切片放在通风处使其干燥,让其够牢固以完成接下来的步骤。
7. 银粒子强化反应:此处理步骤将免疫金粒子(步骤)经由银粒子予以强化放大,使它可以在思思热99re热在线视频下观察。此反应依厂商(Amersham Enhance M or Sigma Silver enhancer Kit)所附的操作说明进行即可。
8. 复染:将切片以0.5%SafraninO或Delafield Haematoxyliny浅染色几秒钟(3-5秒),使组织轮廓可在思思热99re热在线视频下观察。
9. 封片:滴一滴洋杉油在切片上进行封片,或暂时以指甲油封住盖玻片的四周,此时制片工作即告完成。

试剂制备:
1. PBS:磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS 10 mM)将下列盐类溶于100 ml水中:8 g NaCl、 0.2 g KCl、 1.44 g Na2HPO4•2H2O和0.2 g KH2PO4。
2. Blotto:PBS含0.1%BSA及0.05%sodium azide的PBS,并调整pH为7.2。
3. Preimmume serum:5%heat-inactivated normal serum(from the same species as that in which the gold-conjugated secondary antibody was raised)在Blotto中。
4. 免疫金(Immuno Gold or Auro ProbeLM or protein A)用40倍的Blotto溶液稀释。
5. Silver enhancer:solution A:B=1:1,使用前再溷合。solution A as enhancer, solution B as initiator。










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